전주희 엑티브온 책임연구원
[더케이뷰티사이언스] 전주희 엑티브온 책임연구원이 지난해 대한화장품학회에서 주최한 ‘추계학술발표대회’에서 발표한 포스터 논문 ‘감초 유래 세포외 소포체(엑소좀)의 항노화, 피부 회복 및 멜라닌 합성 억제 효과(A Study on Anti-aging, Skin Repair and Melanin Synthesis Inhibitory Effects of Glycyrrhiza glabra-derived Specific Extracellular Vesicles)’을 기고했다.
1. 서론
엑소좀(Exosome)이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 세포밖 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)의 한 종류로 정의된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 하며 이를 위해 세포밖 소포체를 분비한다. 엑소좀은 50~200 nm 정도의 크기를 가지며 단백질, 지질, 핵산 등 생리활성 물질을 포함한다. 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포 내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.
최근 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 항산화, 항염 효과가 밝혀졌다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성, 식물 고유의 유효성분 및 신호전달 물질이 들어있어 세포 간 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노입자이며, 식물에서 분리된 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 높은 안전성과 빠른 흡수력을 가지고 있는 비건 원료이다.
현재까지 대다수의 연구에서 엑소좀은 유체상과의 밀도 및 크기 차이에 기반한 초고속원심분리(Ultracentrifugation) 방법을 통해 분리되었다. 그러나 초고속 원심분리 방법은 엑소좀에 과도한 충격을 주어 엑소좀이 깨질 우려가 있을 뿐만 아니라 노동집약적이며 많은 시간이 소모되는 등의 단점이다. 또한 초고속원심분리 방법은 엑소좀 수율이 떨어지며, 한번에 많은 양의 시료를 분리할 수 없어 산업적 이용 효율이 떨어지는 문제가 있다.
한편, 감초(Glycyrrhiza uralensis)는 장미목 콩과의 여러해살이풀로, 오래 전부터 약용 식물로 사용되어 왔다. 감초는 피부 면역조절에 효과가 있으며 피부의 미백 및 피부 상태를 개선해주는 것으로 알려져 있다. 그러나, 지금까지의 감초 추출 방법은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 공정인 열 환류 및 용매 추출을 필요로 한다. 본 연구에서는 유기 용매를 사용하지 않고 감초 유래 엑소좀의 균일한 크기를 얻는 대안적인 방법으로 접선 흐름 여과(TFF) 방법을 활용하여 아직 밝혀지지 않은 감초 유래 엑소좀의 물리적 특성 및 생물학적 효과를 측정하였다.
이번 연구는 기존 엑소좀의 분리 방법인 초고속원심분리 방법 대신 접선 흐름 여과방법을 채택해 많은 양의 고순도 엑소좀을 분리할 수 있었고, 피부 미백, 상처 회복 및 재생, 주름 개선 등 효능 또한 우수함을 확인하였다.
2. 실험결과
2.1. 분리방법에 따른 엑소좀 특성 비교
기존 엑소좀의 분리 방법인 초고속원심분리와 접선 흐름 여과 방법으로 분리된 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수 및 모양을 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA) 및 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석한 결과 분리된 엑소좀 입자들의 크기는 평균 100 내지 200nm이었으며, 1mL의 단위 부피당 엑소좀의 개수는 약 2.5x1010개로 나타나 기존 엑소좀 분리 방법으로 분리된 엑소좀에 비해 매우 많은 양의 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다. 또한, TEM 분석 결과 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 150nm의 입자의 존재를 확인하였다.
2.2. 분리 방법에 따른 엑소좀의 생물학적 특성과 세포 효능 비교
2.2.1. 엑소좀의 세포 내 투과 효능
기존 엑소좀의 분리 방법으로 분리된 엑소좀(Conventioanl EVs)과 접선 흐름 여과 방법으로 분리된 엑소좀(ACTIVON EVs)의 세포투과 차이를 측정하기 위하여 엑소좀의 지질층을 염색할 수 있는 Dil 염색 시약을 이용하여 엑소좀 표면의 지질층을 염색한 후, 염색되지 않은 염색약은 사이즈 크로마토그래피 방법을 이용하여 제거하였다. 그 후 HaCaT 세포주에 동일한 양의 엑소좀을 처리한 후 4시간 뒤 세포핵을 염색하는 Hoechst을 이용하여 염색한 후 엑소좀이 HaCaT 세포에 투과된 비율을 측정하였다. 세포 비율은 Confocal LSM 880 (Zeiss)을 이용하여 측정하였으며, 기존 방법으로 분리된 감초 엑소좀보다 접선 흐름 여과 방법으로 분리된 감초 엑소좀의 세포투과도가 우수한 것을 확인하였다.
2.2.2. 감초 엑소좀의 상처 치유 효능
기존 엑소좀의 분리 방법으로 분리된 엑소좀(Conventioanl EVs)과 접선 흐름 여과 방법으로 분리된 엑소좀(ACTIVON EVs)의 상처 치유 효능을 확인하기 위하여, 인간 각질세포(HaCaT cell)를 6-웰 플레이트에 2.5×105세포/㎖을 깔고 10%(v/v)의 우태아 혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)을 포함하고 페니실린 7.5mg/L, 스트렙토마이신 7.5mg/L를 함유하고 있는 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양한 후, HaCaT 세포 단일층을 p200 피펫칩으로 ‘긁힘-손상’을 유도하였다. ‘긁힘-손상’된 HaCaT 세포층에 두 가지 방법으로 분리된 감초 엑소좀을 1X108particles/㎖로 각각 처리한 후, 다시 4시간, 8시간 동안 더 배양하였다. 이후, Scion-Image (Scion Corporation, MA) 프로그램을 이용하여 면적비를 계산하였다. 그 결과 음성 대조군(Control) 및 기존 방법으로 분리된 감초 엑소좀보다 접선 흐름 여과 방법으로 분리된 감초 엑소좀을 처리한 군에서 상처 치유 활성이 현저하게 높을 것을 확인할 수 있었다.
2.2.3. 감초 엑소좀의 항노화(주름개선) 효능
기존 엑소좀의 분리 방법으로 분리된 엑소좀(Conventioanl EVs)과 접선 흐름 여과 방법으로 분리된 엑소좀(ACTIVON EVs)의 주름개선 효능을 확인하기 위해 Procollagen Type Ⅰ 생성능 평가를 진행했다. 인간 피부 섬유아세포 HS68세포 (human skin fibroblasts)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum : FBS)에 페니실린 7.5mg/L, 스트렙토마이신 7.5mg/L를 함유하고 있는 DMEM 배지를 사용하여 37℃로 24시간 5% CO2하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 10% PBS로 세척 후 새로운 배지에 엑소좀 1×105세포/well이 되게 각각 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 배양액을 수거하여 Procollagen type-ⅠC peptide (PIP) ELASA kit(takara)를 사용하여 배양액 내 콜라겐 생성량을 측정하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였고, 양성 대조군으로는 TGF-β1를 20ng/mL를 처리하였다. 그 결과 양성 대조군(Control) 및 기존 방법으로 분리된 감초 엑소좀보다 접선 흐름 여과 방법으로 분리된 감초 엑소좀을 처리한 군에서 콜라겐 생성량이 높은 것을 확인하였다.
2.2.4. 감초 엑소좀의 미백 효능
기존 엑소좀의 분리 방법으로 분리된 엑소좀(Conventioanl EVs)과 접선 흐름 여과 방법으로 분리된 엑소좀(ACTIVON EVs)의 미백 효과를 확인하기 위하여, Hosoi et al.(1985)의 방법을 변형하여 멜라닌(Melanin) 생성량을 측정하였다. B16F10 멜라노마 세포를 24웰 플레이트에 각각 1×105세포/well로 접종(seeding)하고 24시간 배양하였다. 그 후 각 well에 1ug/ml의 α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH)을 처리하여 24시간 멜라닌 생성을 유도하고, 감초 엑소좀이 1x108particles/ml가 되게 각각 처리한 후, 72시간 배양하였다. 음성 대조군은 무처리(Control), 양성대조군은 Kojic acid를 100ug/ml 농도로 처리하였다.
72시간 배양한 후 각 well을 PBS로 세척 후 0.2N NaOH 용액 400㎕를 첨가하고 60℃에서 1 시간 동안 용해시킨 후, micro plate reader로 405nm에서 흡광도를 측정하여, 세포외(extracellular)에 존재하는 멜라닌 양을 측정하였다. 측정 결과 기존 방법으로 분리된 감초 엑소좀보다 접선 흐름 여과 방법으로 분리된 감초 엑소좀을 처리한 군에서 더욱 높은 미백 효과가 나타남을 확인하였다.
3. 결론 및 고찰
본 연구에서 적용한 식물 유래 엑소좀 추출방법은 기존 엑소좀 분리 방법과 비교하여 한정된 식물에서 유래된 엑소좀의 추출 효율을 향상시킬 수 있음을 확인하였고, 생물학적 특성 및 효과에서도 기존 엑소좀 분리 방법으로 분리된 감초 엑소좀에 비해 피부 투과 효율이 높을 뿐만 아니라 주름개선, 상처 치유 및 미백에 우수한 효과를 나타내는 화장료 조성물로서의 가치를 확인하였다. 다양한 식물의 엑소좀 효능을 검증하여 소재로 개발한다면 식물 유래 엑소좀의 화장품 뿐만 아니라 식품 및 의약품 원료로도 활용이 가능할 것으로 기대된다.