펩타이드 합성 기술과 마이크로웨이브 펩타이드 합성 시스템
펩타이드 합성 기술과 마이크로웨이브 펩타이드 합성 시스템
  • 전지나 대리(영인에스티, YOUNG IN ST) ( office@thekbs.co.kr)
  • 승인 2019.10.02 13:25
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영인에스티(YOUNG IN ST) 전지나 대리

[더케이뷰티사이언스]  펩타이드는 단백질 구성 요소인 아미노산이 2개 이상 결합되어 단백질 기능을 가지는 물질로 기능성 화장품의 대표 성분 중 하나다. 펩타이드 성분은 인체친화적 물질로 화장품의 원료로 사용할 경우 안티에이징, 미백, 보습 등의 효과를 제공하고 의학적으로도 사용된다.

화장품에서 펩타이드의 효능은 펩타이드 그 자체로 피부 개선에 직접 영향을 미치는 것이 아니라 세포나 DNA를 자극하여 피부개선에 긍정적인 영향을 미치도록 서포트하는 역할을 한다. 또한 펩타이드는 쉽게 변형되거나 산화되지 않고, 체내 유입되어도 아미노산으로 분해되기 때문에 높은 안전성을 지닌다.

이러한 펩타이드 합성의 현재 기술과 마이크로웨이브 펩타이드 합성 시스템을 소개한다.

High Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis(HE-SPPS)

HE-SPPS는 고체상 펩타이드 합성을 위한 중요한 발전이다. 이 기술은 CEM사의 마이크로웨이브를 이용한 SPPS 개발 연구에서 유래되었으며, ‘2003 American Peptide Symposium’에서 처음 소개되었다.1 현재 우리는 SPPS에서 디프로텍션(Deprotection) 과 커플링(Coupling) 단계 모두에 마이크로웨이브 에너지를 사용하여 펩타이드를 합성하는 새로운 프로세스를 도입하였다. 이 기술의 향상된 능력은 CEM사 펩타이드 합성기를 사용한 수천 개의 펩타이드 합성에서 확인했다.2 마이크로웨이브 SPPS를 위해 광섬유 온도센서를 내부에 장착하여 실제 내부의 온도제어 솔루션을 제공한다. 이는 반응 용기의 외부와 내부의 온도가 현저히 다르기 때문에 내부의 온도 제어 및 빠른 가열에 필수적인 기술이다.3

HE-SPPS로 합성된 펩타이드
HE-SPPS로 합성된 펩타이드
표준 및 복합 펩타이드의 합성 응용
표준 및 복합 펩타이드의 합성 응용

2013년에 각 커플링 단계 후에 모든 세척 단계를 제거하고 90°C에서 커플링을 하는 고온의 카르보디이미드(Carbodiimide) 기반으로 하는 진보된 마이크로웨이브 SPPS 방법을 개발했다.4 이 개선된 방법으로 시간과 용제를 상당히 절약하는 동시에 높은 순도 의 펩타이드를 제공할 수 있게 된 것이다. 카르보디이미드 화학반응으로 보다 산성화된 커플링 환경은 이전의 기본적인 커플링 조건(예 : HCTU / DIEA) 에서 문제였던 Cysteine(Epimerization) 및 Arginine(γ-lactam 형성) 에 대한 문제를 해결한다. CEM의 Liberty BlueTM 펩타이드 합성기에 사용된 계측 설계는 HE-SPPS의 중요한 구성 요소로 폐기물의 생성을 증가시키는 비효율적인 내부 유체 및 시약의 경로 세척을 제거했다. Liberty Blue의 HE-SPPS는 현재 전 세계적으로 수백 개의 실험실에서 사용되어 매우 빠르게 고순도 펩타이드를 제공하면서 믿을 수 없을 정도로 낮은 폐기물을 발생시킨다.

CarboMAXTM(Enhanced Carbodiimide Chemistry) 보다 빨라진 커플링: 높아진 순도와 감소된 에피머화(Epimerization)

카르보디이미드 화학반응의 Coupling은 고온 Aminium/ Phosphonium (예 : HATU, HCTU, PyBOP)반응에 비해 상당한 이점을 갖는다. 이것은 Arginine의 Cysteine 과 γ-lactam을 형성 시키는 에피머화의 주요 감소를 포함한다. 그러나, 카르 디이미드에 의한 활성화는 상대적으로 느리다. 이에 카르보디이미드의 양을 아미노산에 비해 2 당량으로 증가시킴으로써 핵심 중간체인 O-acylisourea의 신속한 형성이 가능한 향상된 커플링 공정을 개발했다.1

이 공정은 표준 카르보디이미드 화학반응보다 더 빨리 활성화된 아미노산을 형성함으로써 후속 커플링이 보다 빠르게 일어나게 된다. 이것은 빠른 커플링 시간뿐만이 아니라 민감한 활성 아미노산의 시간을 줄여 에피머화의 감소를 제공한다. 이 기술은 CarboMAX라고하며 CEM의 펩타이드 합성기만 독점적으로 사용 허가된 특허 기술이다.

감소된 에피머화(ex. Liraglutide)
감소된 에피머화(ex. Liraglutide)
UPLC-MS Analysis of crude Liraglutide (CarboMAX)
UPLC-MS Analysis of crude Liraglutide (CarboMAX)
Improved Purity
Improved Purity

산에 민감한 결합의 안정화

많은 중요 측쇄 변형은 고온에서 사용되는 Oxyma Pure 및 HOBt와 같은 산성 활성제에 민감하다. 전통적인 카르보디이미드 화학에서는 포스포(Phospho)나 산소와 연결된 탄수화물과 같은 민감한 그룹의 잘못된 절단(Cleavage)을 초래할 수 있다.

자사는 높은 온도에서 카르보디이미드 화학을 사용하는 동안 이러한 연결을 안정시키기 위해 <1 등가의 염기를 도입하는 특허된 공정을 개발했다. CarvoMAXTM 화학의 일부분인 이 분석법은 CEM의 펩타이드 합성기에서만 사용할 수 있으며 고온 합성 환경에서 비교할 수 없는 속도와 순도의 펩타이드 합성을 지원한다.

Multi-phosphorylated peptide - TpTGNGKPVECpSQPESSFKMpSFKR
Multi-phosphorylated peptide - TpTGNGKPVECpSQPESSFKMpSFKR

One-Pot Coupling/Deprotection 독보적인 속도와 효율성

전통적인 고체상 펩타이드 합성은 반복적이고 개별적인 디프로텍션 및 커플링 단계 그리고 단계 사이의 세척을 포함한다. 이러한 경우 디프로텍션 후에 완전한 세척과 배수가 되지 않은 채 아미노산의 유입이 일어날 수도 있다. 하지만 2013년에 Coupling후 세척단계의 제거는 합성된 펩타이드의 순도에 영향을 주지 않는 것이 입증되었다.5

Liberty PRIMETM은 이것을 적극 활용하여 새로운 One-pot Coupling/Deprotection 공정을 개발하였다.6 이 기술은 커플링 후 배수 되지 않은 합성물에 직접적으로 디프로텍션 시약 (염기)을 첨가한다. 이러한 기술은 용액 단계에서 보다 빠른 반응 활성화가 활성 에스테르의 신속한 가수 분해 또는 자기 축합을 촉진함으로써 수지에 결합된 아미노 작용기에서의 부반응을 피할 수 있다는 이론에 근거한다. 그 후, Fmoc 제거는 상승된 온도에서 중단 없이 진행된다. 최적화된 시약의 사용은 디프로텍션 단계가 끝나고 중성인 반응 혼합물만을 생성하게 된다. 이 새로운 방법은 (a) 디프로텍션 단계에서 약 90%의 용매 사용량 감소, (b) 디프로텍션 후 세척 단계에서 약 75%의 용매 사용량 감소, (c) 냉각 후 승온 시간이 불필요 하여 빠른 디프로텍션 (d) 커플링 후 배수 단계가 불필요 하므로 빠른 사이클 시간을 제공한다.

한편 One-pot Coupling / Deprotection 방법론을 활용하려면 정확한 소량의 농축된 염기를 지속적으로 첨가할 수 있어야 한다. 이를 위해 Liberty PRIME은 커플링 단계가 끝날 때 0.25 mL 정도의 낮은 부피의 디프로텍션 시약을 신속하게 추가할 수 있는 새로운 전용 펌프 모듈을 채택 했다. 사전에 교정된 펌프 모듈은 지속적인 교정을 필요하지 않아 유량의 변동을 피할 수 있다. 또한 주요 용매와 활성제(Oxyma Pure) 역시 모듈 내 유사한 개별 펌프를 통해 공급된다.

Peptide Synthesis on the Liberty PRIME3
Peptide Synthesis on the Liberty PRIME3

 


Minimal Epimerization

Liberty PRIMETM에서 고온 커플링 실험방법 사용시 에피머화 가능성을 조사했다. 특히, 시스테인과 히스티딘(Histidine)은 커플링 동안 에피머화에 민감한 것으로 알려져 있다. 에피머화 정도는 가수 분해, 후속 유도체화, 가스 크로마토그래피 분석 (C.A.T. GmbH)등 잘 알려진 표준 방법을 통해 조사되었다. 실온에서 HBTU / DIEA 활성화를 통해 관찰된 에피머화 정도는 90 °C 표준 또는 CarboMAX 커플링 뿐 아니라 Liberty PRIME를 사용한 105 °C CarboMAX 커플링 보다 높은 것으로 나타났다. 이렇게 90 ℃ 또는 105 ℃의 고온에서 에피머화 변화 없이 커플링이 가능한 것은 Fmoc-His(Trt)-OH 대신에 Fmoc-His(Boc)-OH를 사용하기 때문이다. 이러한 결과는 나아가 표준 HE-SPPS 또는 CarboMAX 커플링 방법이 특히 고온 펩타이드 합성에 적합하다는 것을 보여준다.

ABC 20mer 에서 cysteine과 histidine의 Epimerization level

aFmoc-His(Trt)-OH; bFmoc-His(Boc)-OH; cFmoc-Cys(Trt)-OH
aFmoc-His(Trt)-OH; bFmoc-His(Boc)-OH; cFmoc-Cys(Trt)-OH

Synthesizer Comparison Pick the synthesizer that's best for you.

 

Razor Rapid Parallel Peptide Cleavage at Elevated Temperature 고온에서 신속한 펩타이드 분리(Cleavage)

Razor는 흄후드에 들어가기 쉽게 컴팩트하게 디자인되었으며 최대 12개 각각의 Vessel에 대해 +/-1°C의 온도 조절이 가능하다. 분리는 전형적인 표준 펩타이드의 경우, 단 30 분만에 최대 12개의 펩타이드의 분리를 완료 시킬 수 있다. 분리된 펩타이드는 원심 분리기를 이용해 분리된다. 이 시스템은 단일 펩타이드 및 대용량 배치 모두에 이상적인 시스템이다.

• +/- 1 °C 제어가 가능한 고온 Cleavage Block• 각 Vessel의 독립적인 배수를 위한 밸브 제어• 보관 및 운반이 편리한 각각의 수집용 튜브 트레이• 표준 흄후드에 맞는 컴팩트한 디자인

• +/- 1 °C 제어가 가능한 고온 Cleavage Block
• 각 Vessel의 독립적인 배수를 위한 밸브 제어
• 보관 및 운반이 편리한 각각의 수집용 튜브 트레이
• 표준 흄후드에 맞는 컴팩트한 디자인

Liberty PRO Large Scale Microwave Peptide Synthesis 대용량 맞춤형 펩타이드 합성

Liberty PRO는 세계 최초의 마이크로웨이브를 이용한 대용량 펩타이드 합성 장비다. 빠른 Delivery times으로 최대 500g의 펩타이드를 한 배치에서 합성할 수 있다.

• 낮은 가격 & 빠른 Delivery times• 마이크로웨이브 조사로 인해 향상된 합성 효율• 최대 500g의 정제된 펩타이드 합성(반응 용기:15 L)• Liberty BlueTM 펩타이드 합성기와 동일 스펙

• 낮은 가격 & 빠른 Delivery times
• 마이크로웨이브 조사로 인해 향상된 합성 효율
• 최대 500g의 정제된 펩타이드 합성
(반응 용기:15 L)
• Liberty BlueTM 펩타이드 합성기와 동일 스펙


 

1. Collins, J.M., Collins, M.J., and Steorts, R.C., "A Novel Method for Solid Phase Peptide Synthesis Using Microwave Energy" Biopolymers, 71, 361 2003.

2. US7393920; US7582728; US8058393; JP4773695
3. M. Herrero, J. Kremsner and C.O. Kappe, "Nonthermal Microwave Effects Revisited: On the Importance of Internal Temperature Monitoring and Agitation in Microwave Chemistry," J. Org. Chem., vol. 73, pp. 36-47, 2008.
4. J. Collins, K. Porter, S. Singh and G. Vanier, “High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS),” Org. Lett., vol. 16, pp. 940-943, 2014.

5. Patent Pending: US20170226152; WO2017070512
6. Refer to CEM Application Note ap0131


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