피부노화
인간은 나이가 들어감에 따라 다양한 조직에서 노화를 경험하는데, 인체의 다양한 노화현상 중 피부 노화는 가장 뚜렷하게 시각화 되어 본인과 타인이 인지할 수 있기 때문에 인간이 가장 민감해하는 노화 현상이라고 할 수 있다. 피부노화의 원인은 크게 내인성 요인과 외인성 요인으로 나눌 수 있다. 내인성 요인은 주로 유전적 요인으로 피부 세포 및 조직 구조의 변화를 결정한다. 내인성 요인의 대표적인 예로 말단 소립Telomere은 진핵세포 염색체 말단에 위치한 구조물로 세포가 생리적으로 노화 될수록 말단 소립의 단축이 일어나며, 이는 조직의 탈락률에 영향을 줌으로써 피부노화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.[1] 외인성 요인은 외부에서 유래된 요인으로 태양 자외선, 흡연, 과도한 음주, 영양부족, 스트레스 등이 이에 속한다.[2] 이러한 외인성 요인 중에서 태양 자외선은 피부노화의 80% 이상을 차지하며, 자외선에 의한 노화를 광노화라고 한다.[3][4] 피부의 지속적인 자외선 노출은 피부세포 내 활성 산소종Reactive oxygen species, ROS의 생성을 촉진시켜 산화적 스트레스를 유발하여 세포의 형질전환, 성장, 분화 및 세포사멸에 관여하는 주요 단백질인 활성화 단백질-1Activator protein-1, AP-1 전사인자의 발현을 촉진하여 기질 분해효소인 기질금속단백질분해효소Matrix metalloproteinases, MMPs를 유도하여 세포외 기질Extracellular matrix, ECM의 주요 성분인 콜라겐을 파괴시켜 피부조직을 변화시킴으로써 피부노화를 일으키는 것으로 알려져 있다.[5]~[10]
유전자 보존을 위한 DNA 복구 시스템
모든 생물은 유전자를 보존하기 위해 DNA 복구 시스템을 지니고 있으며, 이 중 자외선으로부터 유발된 DNA의 광손상을 복구하기 위해 뉴클레오티드절단복구Nucleotide excision repair, NER와 염기절단복구Base excision repair, BER라는 시스템을 지니고 있다. NER은 DNA 손상을 인식하는 방법에 따라 글로벌게놈복구Global genome repair, GGR와 전사결합복구Transcription coupled repair, TCR로 나뉘며, 이 두 경로는 DNA 손상의 초기 단계에 서로 다른 단백질들이 관여하며, 그 이후에는 DNA 손상 확인, 이중나선 풀기, 손상된 가닥 자르기 등의 공통된 단계들을 거치면서 손상된 DNA를 복구한다.[11][12]
미세조류
조류Algae는 분류학상 다양한 기원을 가지고 있는데 형태학적으로 단세포형, 군체형, 사상형, 엽상형, 거대 다세포형 등으로 구분되며, 크기에 따라 미세조류Microalgae에서 미역, 다시마 등의 거대조류Macroalgae에 이르기까지 매우 다양하다.[13] 미세조류는 chlorophyll, carotenoid, phycobilins와 같은 색소를 함유하며 주로 광합성을 통해 세포 성장과 번식을 하며, 그 종류나 수가 다양하고 많은 것으로 알려져 있다.[14] 또한 환경조건에 따라 폭발적인 증식력을 가지고 있으며, vitamin, carotenoid, polysaccharides와 같은 다양한 유용물질이 체내에 상대적으로 풍부하게 존재하고 수소, 탄화수소, 생화학 연료 등의 생물 산업 소재로서 저비용, 대량생산이 가능하기 때문에 산업화가 용이하다.[15]-[17] 또한 미세조류는 자외선에 의해 유발되는 세포의 손상을 피하기 위해 자외선에 대한 내성 및 적응성을 높여주는 기작으로 NER과 같은 DNA 복구 시스템과 자외선 흡수물질의 형성을 통한 보호 기작이 알려져 있다.[18]-[22]
DREAMnovel DNA Repair Regulating Material Discovery system
자외선은 피부 노화의 주요 원인이며, 이러한 자외선은 피부의 섬유아세포Fibroblasts를 포함한 피부 세포의 DNA 손상을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 자외선에 노출된 DNA는 티민 이량체Thymine dimer 및 cytosineC→thymineT의 유전적 돌연변이를 유발함으로써, 이러한 돌연변이의 축적은 피부세포 노화 및 피부 악성종양으로 발전할 수 있다. 따라서 자외선에 의한 피부세포 DNA의 손상정도 평가는 티민 이량체 및 C→T의 생성 유무를 정량적으로 평가할 수 있어야 하는데, 이를 손쉽게 평가할 수 있는 새로운 평가법을 개발하고자 하였다. 이를 위해, 루시퍼레이즈Luciferase와 하이포잔틴 포스포리보실 전달효소Hypoxanthine phosphoribosyl transferase, HPRT 유전자를 발현하는 변형된 렌티바이러스Lentivirus를 구축하였으며, 인간진피섬유아세포Human dermal fibroblasts WS-1 세포를 변형된 렌티 바이러스로 감염시키고, 퓨로마이신Puromycin으로 선별하여 루시퍼레이즈와 HPRT가 안정적으로 발현할 수 있는 DREAM-F 세포를 확립 하였다.[23] DREAM system의 첫 번째 단계로 96-well 기반의 스크리닝 단계로 한국생명공학연구원으로부터 제공받은 300여종의 미세조류 추출물을 DREAM-F 세포에 전처리하고 자외선BUVB로 처리하고 세포 생존력과 루시퍼레이즈 활성을 분석하여 자외선 방어효과 및 UVB를 먼저 처리한 후, 추출물을 처리함으로써 자외선에 의해 유도된 손상 복구효과를 확인하였다. 두 번째 단계에서는 첫 번째 단계에서 확인된 미세조류 추출물과 UVB로 처리 된 DREAM-F 세포에서 세포주기 분석 및 세포 사멸을 평가하고, HPRT-DNA 서열분석을 수행하여 첫 번째 단계에서 확인 된 특정 추출물을 검증하였다(그림 1).
자외선에 의해 유도된 피부세포의 항주름 및 항노화 효과
DREAM system을 통해 선별된 Scenedesmus Deserticola JD052 추출물에 대하여 피부세포의 자극성을 평가하기 위해 WST-1 기반의 세포 생존율 시험과 염증 사이토카인Cytokine인 interleukin-1βIL-1β와 interleukin-6IL-6 Real-time polymerase chain reactionqRT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, JD052 추출물은 상대적으로 매우 낮은 세포독성을 나타냈으며, 염증 사이토카인인 IL-1β와 IL-6의 분비도 나타나지 않아 JD052 추출물은 피부세포에 자극이 거의 없음을 확인하였다(그림 2A, 2B).
JD052에 대한 항주름 효능 평가는 우리나라 식품의약품안전처의 주름개선 효능 시험 가이드라인에 명시된 시험법을 통해 콜라겐Collagen 및 콜라게나제Collagenase 발현량을 측정하였다. 그 결과, JD052 추출물은 피부세포 내 콜라겐 유전자인 COL1A1Alpha-1 type I collagen gene 및 COL3A1Alpha-1 Type III Collagen gene mRNAMessenger RNA 발현을 매우 높게 유도함을 확인하였고, 콜라겐 분해효소인 MMP-1Matrix metalloproteinase-1 gene mRNA 발현을 억제하는 결과가 확인되어, JD052 추출물이 콜라겐 발현을 증가시키고 콜라게나제 발현을 억제함으로써 항주름 효과가 있는 것을 확인하였다(그림 2C, 2D).
피부노화는 나이가 들어감에 따라 나타나는 자연 노화와 자외선에 의한 광노화로 나눌 수 있다. 특히 광노화는 자외선에 의한 피부세포의 영향이 조절된다면 노화를 억제할 수 있는 특징을 가지고 있다. 따라서 JD052 추출물이 자외선에 의한 광노화를 억제할 수 있는지를 확인하였다. 그 결과, JD052 추출물은 UVB에 의한 세포 생존율 감소를 억제하는 것을 확인하였다(그림 3A). 또한 UVB가 미치는 피부 세포 내 가장 대표적 영향은 활성산소의 증가이다. JD052 추출물을 이용하여 피부세포 내 활성산소의 농도변화를 알아보기 위해 dichlorofluorescin diacetateDCF-DA 시험을 수행한 결과, JD052 추출물은 UVB에 의해 증가된 활성산소를 현저히 감소시키는 결과를 확인하였다(그림 3B).
상기의 결과를 바탕으로 자외선에 의한 피부세포의 성장 억제와 노화, 그리고 DNA 손상이 JD052 추출물에 의해 조절되는지를 확인하였다. 실험 결과, 자외선에 의한 피부세포의 성장력은 현저히 감소하였으나, JD052 추출물을 전처리한 피부세포는 자외선에 의한 성장저해가 억제됨을 확인했다(그림 4A, 4B). 세포의 노화 지표인 beta-galactosidase를 이용한 실험 결과, 자외선에 의해 beta-gal 양성 세포가 대조군 대비 약 3배 이상 증가하였으나, JD052를 전처리한 세포에서는 대조군 수준으로 현저히 감소하였고, 세포 내 노화 분자 지표인 p21과 p16의 발현이 JD052 추출물에 의해 감소되었다(그림 4C, 4D). 또한 자외선에 의한 DNA 손상을 측정하기 위해 티민 이량체 블롯팅Thymine dimer blotting을 수행한 결과, JD052 추출물이 자외선에 의한 티민 이량체 형성을 억제함을 확인하였다(그림 4E).
자외선에 의한 항노화 효능을 확인하기 위하여 COL1A1, COL3A1, MMP1, MMP3 mRNA 발현을 qRT-PCR로 측정한 결과, 자외선은 COL 관련 유전자의 발현을 현저하게 억제하고, MMP 관련 유전자의 발현을 증가시켰으나, JD052 추출물을 처리한 실험군에서는 자외선에 의한 영향이 확연하게 억제되는 것을 확인하였다(그림 5).
JD052 추출물은 자외선에 의한 손상 피부 자극 진정 효과와
진피치밀도 개선을 통해 피부탄력, 주름개선 및 진피 보습에 뛰어난 효과를 보였다.
임상시험평가
상기의 결과를 통해 자외선으로부터 피부세포의 보호 능력 및 자외선에 의해 손상된 세포의 회복 능력이 확인된 JD052의 추출물을 이용하여 항염증성 자외선 손상 보호용 화장료 원료로서 그 가능성을 확인하였다. 이를 위해 29세 이상의 성인 여성을 대상으로 JD052 추출물을 포함하는 제형(토너, 로션, 크림)을 4주간 적용하여 자외선에 의한 손상 피부 자극 진정효과, 진피치밀도, 주름, 진피 보습 개선에 대한 인체효능에 대한 효과를 검증하고자 한국 피부과학연구원에 의뢰하여 인체 효능평가를 진행하였다(KISCS-AFH023-RBO).
Solar simulator (Multiport Simulator 601- 300W, Solar Light Company, Inc., USA)와 ANTERA 3D (Miravex, Ireland)를 이용하여 왼쪽 상완부위의 자외선에 의한 손상 피부 자극 진정효과 개선도를 분석한 결과, 피부 붉은기를 나타내는 a* value가 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 도포부위에서 5.30%, 무도포부위에서 1.68%, 4주 사용 후 도포부위에서 5.54%, 무도포 부위에서 3.59% 감소되는 변화를 나타내었다(그림 6). 또한 시험물질 무도포부위의 2주 사용 후, 4주 사용 후 Δa* value와 비교하여 도포부위의 2주 사용 후, 4주 사용 후 Δa* value가 각각 0.024와 0.031로 통계적으로 유의하게 나타나(p<0.05) 시험 물질이 자외선에 의한 손상 피부 자극 진정효과에 도움을 주는 것으로 확인되었다.
DUB-Skin Scanner (Taberna pro medicum, Luneburg, Germany)를 이용하여 왼쪽 눈꼬리 옆 3 cm 부위의 진피치밀도 개선도를 분석한 결과, 진피치밀도가 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 12.08%, 4주 사용 후 21.15% 증가되는 변화를 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후, 4주 사용 후 밀도 값이 통계적으로 유의하게 나타나(p<0.001) 시험물질이 진피치밀도 개선에 도움을 주는 것으로 확인되었다(그림 7).
ANTERA 3D를 이용하여 오른쪽 눈꼬리주름부위의 주름 개선도를 분석한 결과, 피부의 주름을 나타내는 wrinkle small 값이 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 5.88%, 4주 사용 후 8.35% 감소되는 변화를 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후, 4주 사용 후 통계적으로 유의하게 나타나(p<0.01, p<0.001) 시험물질이 주름 개선에 도움을 주는 것으로 확인되었다(그림 8).
MoistureMeterD Compact (Delfin Technologies Ltd., Finland)를 이용하여 왼쪽 볼부위의 진피 보습 개선도를 분석한 결과, 진피 수분이 시험물질 사용 전과 비교하여 1회 사용 직후 23.54%, 2주 사용 후 4.32%, 4주 사용 후 6.48%가 증가되는 변화를 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 1회 사용 직후, 2주 사용 후, 4주 사용 후 통계적으로 유의하게 나타나(p<0.001) 시험물질이 주름 개선에 도움을 주는 것으로 확인되었다(그림 9).
피시험자를 대상으로 설문조사를 한 결과 홍반, 부종, 인설생성, 가려움, 자통, 작열감, 뻣뻣함, 따끔거림에 대한 특별한 피부이상 반응은 관찰되지 않았다(표 1).
이러한 결과들은 JD052 추출물이 자외선에 의한 손상 피부 자극 진정효과와 진피치밀도 개선을 통한 피부탄력, 주름 개선 및 진피 보습 개선에 뛰어난 효과를 가지고 있음을 본 임상시험을 통해서 확인할 수 있었다.
미세조류 대량배양을 위한 종속배양Heterotroph
미세조류를 상업화하기 위해서는 무엇보다 대량 배양이 가능한 시스템을 갖추는 것이 중요하다. 본 연구를 통해 선정된 JD052의 대량 배양을 위해 미생물 배양기를 이용할 수 있는 종속배양을 수행하였다. 이를 위해 JD052를 대상으로 광합성배양Phototroph, 혼합배양Mixotroph 그리고 종속배양 조건으로 배양하여 생물량Biomass과 이에 대한 추출물을 제조하여 생산성과 피부세포에 대한 자외선 보호 및 복구활성을 비교 분석하였다. 그 결과, 종속배양 및 혼합배양은 광합성배양과 비교하여 미세조류 생산성이 약 3배 이상 높았으며, 세포 생존율 시험의 경우 3가지 배양 조건에서 크게 차이나지 않았다(그림 10, 11). 상대적 세포생존에서 대조군 값을 제외한 값을 상대적 활성 단위인 Relative activity unitRAU로 정의하고, 각 배양 조건의 세포생산성을 이용하여 상대적 활성단위 생산성RAU productivity을 계산하였다. 그 결과, RAU는 광합성 배양 21.46, 혼합배양 17.20, 종속배양 19.30으로 나타났으며, 이를 통해 RAU 생산성을 계산한 결과, 광합성배양 6, 혼합배양 16, 종속배양 16으로 광합성 배양에 비해 생산성이 약 2.7배 증가함을 확인하였다(그림 12). 따라서 종속배양에 의한 미세조류의 배양은 광합성 배양에 비해 높은 생산성과 용이한 생산확장성이 있어 JD052를 비롯한 미세조류의 산업화에 매우 유리하게 작용할 것으로 판단된다.
DESERTICA-항광노화 소재
이 연구에서는 세계 최초로 자외선 의존적 피부세포 DNA손상 조절 신규 물질 발굴시스템인 DREAM system의 개발과 이를 통해 선정된 JD052 미세조류 추출물에 대해 자외선에 의해 유도된 피부세포의 항주름 및 항노화 효과를 확인하였으며, 임상시험을 통해 자외선에 의한 피부 자극 진정효과, 진피치밀도, 주름 개선 및 진피 보습 개선에 도움을 주는 것을 확인하였다. 또한 JD052의 산업화에 필요한 대량생산 방법으로 종속배양 기법을 확립하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 JD052 추출물이 포함된 원료 ‘DESERTICA’를 개발하여 자외선으로부터 피부세포를 보호하고, 피부세포의 DNA 복구 효능을 나타내는 항광노화 화장품 소재로서 그 가능성을 확인하였다.