[우수 논문상 수상자 기고]
인간표피 각질형성 세포에서 대기 미립자 물질 PM10에 의해 유도되는 반응성 산소종의 생성에서 Dual Oxidase 2의 역할
심각한 건강 문제를 일으키는 대기 미립자 물질airborne particulate matter, PM은 탄소 중심의 연소 입자들, 2차 무기물 및 지각의 파생 입자를 포함하는 다양한 물질의 혼합체이며, 입자의 크기에 따라 10μm 이하의 미세먼지 PM10, 2.5μm 이하의 초미세먼지 PM2.5, 그리고 0.1μm 이하의 극미세먼지 PM0.1로 구분한다.
PM에 지속적으로 노출되면 호흡기질환 및 심혈관질환의 발병률이 증가하고 사망률도 높아진다. 피부는 대기 미세먼지에 직접적으로 노출되는 신체 외부 기관으로서 일반인의 경우 모공을 통한 PM의 침투가 가능하고, 피부 장벽이 불완전한 어린이와 환자의 경우에는 PM의 경피 흡수가 더 심해진다. PM은 다양한 메커니즘으로 인해 아토피성 피부염atopic dermatitis, 여드름acne, 건선psoriasis 등 염증성 피부질환을 유발하거나 악화시킨다.
PM은 활성산소종reactive oxygen species, ROS의 생성 및 tumor necrosis factor- (TNF-), interleukin-1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6), interleukin 8 (IL-8), interferon- (IFN-)과 같은 염증성 사이토카인의 분비를 유도한다. 또한 PM의 노출에 의한 ROS의 증가는 matrix metalloproteinases를 증가시켜 콜라겐의 분해를 초래한다.
NADPH oxidase (NOX) family는 세포 내 ROS의 공급원으로 NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5 및 dual oxidase(DUOX)1과 DUOX2 등 7개의 동족효소를 포함한다. 각 효소를 구성하는 단위체들은 서로 다르지만 NADPH에서 산소로 전자를 전달하여 ROS를 생성하는 촉매 활성을 공유한다. 이러한 NOX family 효소는 숙주 방어 및 세포 신호 전달과 같은 생리학적 과정과 면역 억제, 갑상선 기능 저하증 등의 병리학적 과정에서도 중요한 역할을 한다.
DUOX1과 DUOX2는 maturation factor인 DUOXA1과 DUOXA2를 각각 결합하여 원형질막에 기능성 복합체로서 분포하며, 다른 NOX family 효소들과는 다르게 칼슘 의존적이고, 세포 내 칼슘 이온의 증가에 의해 활성화되어 과산화수소를 생성한다. 다른 연구팀은 분진 입자에 노출된 폐섬유아세포에서 세포 내 칼슘 이온 의존성 신호전달과 ROS가 유도된다고 보고하였다. 또한 여러 NOX family 중 DUOX2/DUOXA2의 변이가 선천성 갑상선기능저하증 및 크론병과 연관이 있다고 보고되었다.
본 연구는 인체 표피 각질형성세포에서 PM10에 의해 유도된 ROS 생성의 초기 분자 기전을 규명하고자 수행하였다. 특별히 DUOX2의 기능에 중점을 두었으며 주요 연구 결과는 다음과 같다.
1. PM10이 ROS를 생성하는지 알아보기 위하여, 인체 각질형성세포를 배양하고 ROS 탐지용 형광 시약을 준 다음 항산화제인 apocynin의 유무 조건에서 PM10을 처리하였다. 형광현미경을 통해 관찰한 결과 PM10에 의해 세포 내 형광 강도가 증가하였고 이러한 변화는 apocynin에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. 이는 PM10에 의한 세포 내 ROS 생성 증가를 확인하여 주었다.
2. 각질형성세포에서 미세먼지에 의한 다양한 NOX family의 유전자 발현 변화를 알아보았다. 배양된 세포에 PM10을 농도를 달리하여 처리하고 NOX family에 속하는 6종의 효소들의 mRNA 발현 변화를 RT-PCR로 분석하였다. 각질형성세포에서의 상대적인 mRNA 발현 값은 DUOX1과 DUOX2가 다른 효소 4종에 비해 현저히 높았고, 미세먼지를 처리하지 않은 군과 비교하였을 때 NOX1와 NOX2는 1.7배, DUOX1은 1.3배, DUOX2는 4.1배 증가하였다. DUOX1과 DUOX2의 활성에 필수적인 각각의 maturation factor인 DUOXA1과 DUOXA2의 발현도 PM10에 의해 농도의존적으로 증가되었다.
3. PM10에 의한 각질형성세포에서의 ROS의 생성에서 세포 내 칼슘의 필요 여부를 파악하기 위하여 다음 실험을 수행하였다. 배양 세포에 세포막 투과성 칼슘이온의 킬레이터인 BAPTA-AM을 전처리한 후 PM10에 노출시킨 결과 ROS 생성이 BAPTA-AM의 농도에 의존적으로 감소되었다. 또한 세포에 A23187를 처리하여 세포 내 칼슘이온을 직접적으로 증가시킨 경우에도 ROS 생성이 유도되었고 이 또한 BAPTA-AM의 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었다.
4. PM10에 의한 ROS 생성에 있어 칼슘의존적 효소인 DUOX1과 DUOX2의 역할을 알아보고자 각각의 작은 간섭 RNA (siRNA)를 이용한 실험을 수행하였다. siDUOX1는 DUOX1의 유전자 발현을 감소시켰고 DUOX2의 유전자 발현에는 영향이 없었다. 또한 siDUOX2는 DUOX2의 유전자 발현을 감소시켰고 DUOX1의 유전자 발현에는 영향이 없었다. 즉 특정 siRNA를 사용하여 DUOX1과 DUOX2 둘 중 하나만을 선택적으로 저해할 수 있었다.
5. siDUOX1을 처리하여 DUOX1의 유전자 발현이 선택적으로 감소된 군에서는 PM10에 의한 ROS 생성에 변화가 없었지만, siDUOX2를 처리하여 DUOX2의 유전자 발현이 감소된 군에서는 PM10에 의한 ROS 생성이 현저히 감소되었다. 이를 통해 PM10에 대한 ROS 생성에 있어 DUOX1이 아닌 DUOX2가 중요한 역할을 함을 확인하였다.
6. DUOX2의 역할과 염증성 사이토카인과의 발현간의 관련성을 알아보고자 siDUOX2를 전처리하여 DUOX2의 발현을 감소시킨 각질형성세포에서 PM10에 의한 여러 염증성 사이토카인들의 발현 변화를 분석하였다. PM10은 DUOX2뿐만 아니라 IFN-, IL-1, IL-6 및 IL-8의 mRNA 발현을 증가시켰다. PM10에 의한 DUOX2와 IFN-의 mRNA 발현은 siDUOX2에 에 의해 억제된 반면 PM10에 의한 IL-6와 IL-8의 mRNA 발현은 오히려 증진되었다. PM10에 의한 IL-1의 mRNA 발현에는 siDUOX2가 영향을 미치지 않았다.
PM10에 의해 유도되는 칼슘 의존적 ROS 생성은 각질형성세포의 부정적인 분화를 촉진할 수 있다. DUOX2의 발현이 Th1 사이토카인인 IFN-에 의해 조절되고, 역으로 IFN-의 발현도 DUOX2에 의해 조절된다. 건선과 같은 만성염증성 피부 질환, 알레르기성 접촉 피부염 및 아토피성 피부염은 각질형성세포 포함 T림프구의 강렬한 침윤을 특징으로 하는데, T세포-유도 사이토카인 중에서 IFN-가 가장 강력하게 염증반응을 활성화한다.
본 연구에서 미세먼지에 노출된 피부에서 활성산소의 생성과 염증 반응의 발현을 주도하는 DUOX2와 IFN-가 유용한 치료 표적임을 시사하였다(그림 1a). PM10에 의해 유도되는 DUOX2와 IFN-의 발현을 억제하는 석류의 푸니칼라긴, 녹차의 EGCG 등 항산화제가 피부 염증의 예방 및 치료에 유용할 것으로 기대된다(그림 1b).