1. Skin moisturization at a molecular level - Key Note Lecture
Rainer Voegeli-DSM, France
건성 피부는 물의 결핍만으로 볼 수 없다. 각질층SC은 물이 부족할 수 있는 유일한 피부층인데, 성인의 경우 건조한 피부가 수분을 충분히 공급받기 위해서는 약 3mL의 물이 필요하다. 하지만 피부를 통해 흐르는 물의 양은 관련이 없고, ‘각막세포corneocyte’만이 물을 유지할 수 있는 능력을 갖고 있다. 따라서 정밀하게 조정된 일련의 상호 작용에 의해 맞물려 있는 생화학적 및 생물리학적 메커니즘으로 각질층 내 수분 균형이 유지된다. 다시 말해, 각질세포 봉투corneocyte envelopes의 성숙, 장벽 지질의 형성과 구성, 필라그리노 분해filaggrinolysis 및 NMF 생성이다. 꼭대기에는 주로 단백질 분해 효소와 억제제에 의해 조절되는, 양쪽 모두 각질층의 일정한 두께를 유지하기 위해 균형을 유지하는 corneodesmosomes의 파괴가 겹쳐있다. 건성 피부 질환의 발생은 각질층이 분화하는 동안 수분 보유 능력을 만들고 보호하는 이러한 중요한 과정들 중에서 하나 또는 그 이상의 기능장애에 의해 유발된다. 우리는 새로운 보습제의 기초가 각질층의 효과적인 성숙과 박리를 이해하는데 있다고 믿고 있다.
2. Improving elasticity by reversing histone modification induced after UVA damage
Pelletier Nicolas-BASF, France
BASF는 UVA 손상으로 유도된 히스톤Histone 변 형을 역전시키는 방법에 대한 연구 결과를 발표했다. 이 연구 결과는 광노출 후 보다 건강한 피부를 유지하는 데 도움이 될 수 있는 제품들을 선택하는 기준을 제공하였다. 이번 연구에서는 사람 섬유아세포를 대상으로 자외선(UVA, 315~380nm, 10J/cm2 or 7.5 for immunostaining)을 조사하고 이때 histone deacetylaseHDAC 저해제로 sodium butan-oateNaBu 20mM 및 TSA 200mM을 사용하여 히스톤 아세틸화를 조사하였다. 이 때 천연 식물 추출물(0.4%)의 효과도 측정했다. 분석은 Shotgun histone PTMs(LC-MS/ MS), Immunostaining H3K27ac, AlphaLISA H3K27ac 및 Capillary western blot으로 fibulin 5, elafin 및 MMP1을 측정했다.
섬유아세포로부터 아세틸화된 히스톤 추출 및 확인 방법은 △섬유아세포로부터 핵 추출 △히스톤 추출 △프로피온일화 소화 및 프로피온일화 △LC-MS/MS로 분리 및 분자량 측정을 통해 확인했다.
◆ UVA 노출 혹는 HDAC 저해제 처리 후 AlphaLISA assay 와 immunostaining of H3K27
아세틸화 수준의 면역염색
=Sodium butyrate (NaBu)로 처리한 후 16시간 뒤에 AlphaLISA로 분석했을 때 H3K27 아세틸화 검출은 섬유아세포에서 크게 증가하였다. 이러한 결과는 면역 염색법으로 확인했다. 연구진은 H3K27의 아세틸화가 양성대조군으로 사용한 NaBu HDAC 저해제와 7.5J/cm²의 UVA 모두에서 유도됨을 확인했다.
◆ Western blot: UVA 노출 혹은 HDAC 저해제 처리 후
Fibulin 5, Elafin 및 MMP1 단백질 수준
=Histone PTMs에 의해 조절되는 것으로 기술되는 탄성 섬유(구조·기능)에 포함된 단백질에 초점을 맞추었다. 연구진은 fibulin 5와 elafin 단백질 함량이 감소한 반면 MMP1은 10J/cm² UVA와 HDAC 저해제 처리 후 감소했다. 하지만 UVA 유도는 UVA로 처리된 섬유아세포의 적당한 염색에서 시사되는 것과 같이 pan-HDAC 저해제로 처리된 세포에 있어서 강한 녹색 염색과 비교하여 중간 정도의 염색 강도로 나타났다.
◆ UVA 노출 후 H3K27 아세틸화 및 단백질 발현 회복에 대한
식물 추출물의 효과
=0.4% 식물추출물이 pan-HDAC 저해제 NaBu에 의해 유도된 H3K27 아세틸화를 최소 1.9 배 보상(equivalent to -402%)할 수 있었다. 또한 UVA 노출 또는 히스톤 아세틸화에 의해 개시된 fibulin5 및 MMP1 변화를 보상할 수 있다. 식물 추출물의 선량 의존적 영향 또한 관찰되었다.
연구진은 histone post-translational modification이 Shotgun analysis로 UVA에 노출된 정상 사람 피부 섬유아세포를 대상으로 연구된 것은 처음이라고 언급하고 있다. UVA는 pan-HDAC 저해제 보다도 post-translational histone modification을 보다 더 높은 수준으로 이끌었다. 연구진은 메틸화보다도 더 히스톤 아세틸화 변화가 일어남을 입증했다. Histone PTMs 중에서 처음으로 H3K27 아세틸화 변조를 연구했다. H3K27 아세틸화 수준은 UVA에 의해서는 중간 정도로 유도되었고, pan-HDAC 저해제에 의해서는 높게 유도되었다. 병렬적으로, pan-HDAC 저해제와 UVA는 MMP1을 증가시켰고 2 elastic fiber partner는 감소시키는 것으로 나타났다. 식물추출물을 평가한 결과, 식물추출물은 UVA 노출 후 피부 탱탱함과 탄력을 유지시키는데 도움을 주기 위해 유도된 H3K27 아세틸화 및 진피 단백질 변화 모두를 보상할 수 있는 것으로 나타났다.
3. A hydrosoluble extract from Oenothera biennls cell culture
produces skin anti-ageing effects by improving cell mechanical properties
Annallsa Tito et al., Italy
달맞이꽃 세포배양 수용성 추출물을 대상으로 화학적 관점에서 연구하였다. Oenothera biennis 추출물은 MYLK gene 발현을 증가시킴으로써 매 트릭스 콜라겐 수축, actin 중합 및 세포외 매트릭스 단백질ECM 생성을 촉진할 수 있음을 보여준 연구이다.
이번 연구는 피부노화를 억제하는 새로운 모델을 제시했다.
달맞이꽃 식물 줄기세포 캘러스 배양 추출물ObHEx은 피부 외식편explant에서 MYLK 합성을 자극하고 결과적으로 myosin 인산화를 유도했다. 또한 ObHEx은 actin polymerization을 50% 유도했고 이러한 효과는 MYLK 특이적 저해제인 ML7에 의해 완벽하게 억제되었다. ObHEx은 섬유아세포에 의한 콜라겐 수축을 46% 자극했고 이러한 효과는 ML7 존재로 완벽하게 저해되었다. ObHEx은 Smad 활성을 40~80% 자극했고 이러한 효과는 ML7 존재로 완벽하게 저해되었다. 0.002% ObHEx은 Procllagen 1, Periostin과 Tropoelastin을 각각 98, 51 alc 75% 자극했고. Ex vivo 실험으로, 피부 외식편에서 ECM 단백질을 측정했다. 기계적 힘을 증가시키면 새로운 진피 단백질 증가를 개시시켰다. 즉 ObHEx은 피부 세포의 기계적 성질을 자극하여 ECM 매트릭스 단백질을 유도하는 TGFβ RII를 활성화시켰다.
노화된 피부(감소된 피부 기계적 성질, 파괴된 얇은 피부 진피)가 달맞이꽃 식물 줄기세포 캘러스 배양 추출물ObHEx로 Mylk 활성화를 경유하여 피부 세포 수축과 개선된 진피 구조로 인해, 피부 기계적 성질 회복, 콜라겐 섬유 수축 자극, 새로운 매트릭스 성분 증가, 피부 늘어짐과 탄력에 이중으로 작용하여 목주름 감소에 상당한 효과를 나타냈다.
4. Methoxy-Monobenzoylmethane(MeO-MBM) prrotects skin from UV induced
damages and prevents signs of inflammation while improving the skin barrier.
Joerg von Hagen-Merck, Germany
이번 연구에서는 UVB나 UVA 필터는 아니지만 주로 UVB 광조사 하에서 잘 알려진 UVA 필터인 아보벤존Avobenzone으로 전환하는 methoxy-monobenzoylmethaneMeO-MBM 이라는 물질로 아보벤젠의 문제점 해결을 목표로 하였다.
MeO-MBM의 항산화 및 세포내 라디칼 생성 특성을 avobenzone과 비교하였다. MeO-MBM에 자외선 조사를 하면 아보벤존으로 전환 후 UVA 영역에서 UV 흡수가 in vitro 및 in vivo 모두에서 증가하였다. HPTLC 및 UHPLC 연구는 250 kJ/m2 광조사후 in vitro에서 MeO-MBM의 전환율이 48.8%에 도달할 때까지 avobenzone으로 전환됨을 보여주었다. 또한 항산화 활성도 관찰되었다. 100 μM MeO-MBM은 DPPH 시험에서 11.2%로 측정되었으나 광조사 후에는 9.7%로 감소되었다. 케라티노사이트에서 MeO-MBM은 라디칼 개시제로 tBHP를 사용했을 때 세포내 ROS를 90%까지 감소시켰다. 이 결과들은 MeO-MBM이 avobenzone으로 전환되는 과정동안 항산화 물질로서 광 항산화제로서 작용함을 가리킨다.
이 연구는 동적 기능이 있는 국소 도포 응용을 위한 활성 성분의 개발에 대한 통찰력을 제공한다. 이러한 접근법을 이용해서, 연구자들은 MeO-MBM이 세포 스트레스에 대항하여 동시에 피부 세포에 자외선으로부터의 보호 기능을 확장할 수 있는 가능성을 확인하였다(그림 5).
5. RONACARE BALMANCE : Surface Solution-Cosmetics - A Cornflower
Extract Containing N-Feruloylserotonin Reduces Inflammation in Human Skin
by Neutralizing CCL17 and CCL22 and Inhibiting COX-2 and 5-LOX
Marina Lefort-Merck, Germany
옥수수꽃 추출물과 N-feruloyl-serotoninmos-chamine을 대상으로 피부 자극, 피부 염증, 만성 및 급성 염증, 사이토카인 발현, 항산화활성 등을 평가하고 과민성 피부에서 피부 보호, 피부홍반, 가려움증 등 피부 스트레스에 대한 보호작용을 평가했고, 제품 ‘RonaCare Balmance’에 적용했다. 피부 자극 및 염증 관련 연구 내용은 다음과 같다.
흉선과 활성 조정 케모카인(TARC/CCL17) 및 마크로파지 유래 케모카인(MDC/CCL22)은 type 2 helper T(Th2) 세포의 표면에서 발현된 공통 수용체 CCR4에 결합하여 활성화함으로써 그들의 생물학적 효과를 발휘하는, 두 개의 핵심 케모카인이다. 진피에 있는 Th2 세포를 모집함으로써, CCL17 및 CCL22은 아토피 피부에서 염증의 진전을 촉진한다. 이 연구의 목적은 아토피성 피부를 가진 사람들에게 유익할 수 있도록 국소적으로 도포될 때 생물학적 성질을 가진 식물 추출물을 개발하는 것이다. 이를 위해 CCL17 및 CCL22의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 리간드를 식별하는 것으로 구성되었다. 따라서, 컴퓨터 시뮬레이션과 같은 가상 환경에서의 분자 모델링과 일반 선별 검사는 이들 두 케모카인들을 결합하고 차단하는 자연 분자들을 가려내기 위해 개발됐다.
N-Feruloylserotonin은 이 실험에서 CCL22의 중성리간드neutraligand로 확인됐다. N-feruloy-lserotonin을 함유하는 옥수수꽃 추출물을 in vitro 실험에 사용하기 위해 선택하였다. 추출물이 있을 때와 없을 때 CCL17 혹은 CCL22에 의해 유도되는 염증 바이오마커의 유전자 발현의 변화를 HaCaT keratinocyte 세포주에서 평가했다.
또 옥수수꽃 추출물은 in vitro에서 두 가지 케모카인 cyclooxygenase-2COX-2 및 5-lipoxygenase5- LOX를 중화시키는 것으로 관찰되었고, 주로 N-feruloylserotonin의 존재에 기인하여 항염증 활성을 가짐을 확인하였다. 실험 결과는 in vivo 연구에서 확인이 필요하지만, in vitro 연구에서 아토피성 피부를 지닌 사람들에게 국소적으로 적용될 때 옥수수꽃 추출물의 잇점을 설명할 수 있는 토대가 마련된 것으로 판단된다.
6. Alteration to the Skin Barrier Integrity and Ceramide Profile Following Broad-
Spectrum UV Exposure in an Ex Vivo Tissue Model
Rebecca Barresi-Loreal, USA
태양광선에의 노출과 피부 건강 사이의 관계에 대한 최근의 이해에도 불구하고, 보호되지 않은 UV노출과 장벽의 온전성 관계에 대해서는 거의 알려진 것이 없다. 이번 연구는 피부 장벽 온전성과 건강의 세 가지 주요 지표, 즉 △구조 성분 △분자 바이오마커 △세라마이드 프로파일을 평가함으로써 장벽 손상 메커니즘에 대한 추가 지식을 발견하는 것을 목표로 하고 있다. 이번 연구 결과는 다음과 같다.
이 연구는 시뮬레이션된 UVA/UVB 노출 후, 생체 외 조직 모델을 사용하여 자외선 조사와 피부 장벽의 관계를 밝히기 위한 새로운 과학적 증거를 입증하기 위해 진행됐다. 넓은 범위의 스펙트럼을 갖는 자외선차단제가 있을 때와 없을 때 그리고 생리학적 또는 그 이상의 UV 선량을 높인 조건에서 생체 외 인체 피부를 노출시켰다. 광조사 후, 생체외 조직 모델에서 구조 분자의 변화를 평가했다. UV로 조사된 피부는 표피세포 사멸을 나타냈고 핵심 장벽 단백질의 발현을 변형시켰다. TEM 분석은 생리학적 및 광범위한 자외선 노출 이후 조직층 사이에서 접합과 해리의 붕괴를 입증했다. 필수 피부 세라마이드를 함유한 효과적인 넓은 폭의 스펙트럼을 갖는 자외선차단제는 그러한 변화로부터 피부를 완벽하게 보호했다. 이것은 생체외 조직 모형에서 생리적으로 적절한 용량을 사용하여 변형된 피부 장벽 온전성을 회복하는 확실한 상관관계를 입증하는 첫번째 연구 사례다.
이번 연구는 태양광선 노출은 병리학적 피부상태에 비교되는 급성 피부 장벽 파괴를 유도할 수 있음을 가리킨다. 장기간 자외선 노출은 핵심 기저막 단백질의 파괴와 세라마이드 아강subclass의 정상적인 분포 그리고 지질 생합성 과정의 변화를 통한 매우 긴 사슬 아실chain acyl 부분를 변경시키는 것과 동시에 표피 세포 사멸을 초래한다. 세라마이드 함유 자외선차단제는 관찰된 구조적 변화를 개선시키고, 건강한 세라마이드 아강subclass과 사슬 길이 프로파일의 품질을 보존하는데 도움을 주었다. 이러한 관찰은 햇볕에 피부가 손상되기 쉬운 취약점이 있음을 강조하고, 전반적인 피부 건강을 강화하고 지속적으로 회복할 수 있는 세라마이드 함유 처방을 이용한 선케어 전략이 보다 효과적인 관리를 할 수 있도록 해준다는 점을 시사하고 있다.
7. A new model to quantify melanosome transport and explore its underlying
mechanism in keratinocytes and melanocytes
Wang Peiyu-Yunnan Baiyaao Group Health Products Co.-China
멜라노솜 전달은 피부 색소침착에 중요하지만 이에 대한 연구는 많지 않다. 또 이러한 연구를 위한 적절한 모델 시스템이 없다. 이번 연구에서는 멜라노솜의 케라티노사이트로의 전달을 정량하고 그 메커니즘을 탐구하는데 적절한 모델 시스템을 개발하는 것이다. 이를 위해 멜라노사이트와 케라티노사이트의 공배양, 멜라노솜 전달의 정량법, 기본 메커니즘 탐구(면역형광염색, TEM, 멜라노솜 전달 조절 단백질)를 수행하였다.
멜라노솜에 특이적인 마커인 anti-cytokeratin 14 항체와 anti-gp-100 항체에 의한 PET 막의 PAM212 면역표지법Immunolabelling은 멜라노좀이 케라티노사이트로 전이 되었는지를 확인하기 위해 사용되었다. cytokeratin 14 형광과 gp100 형광이 멜라노솜이 케라티노사이트로 전이되었음을 가리키는 PAM212에서 발견되었다. cytokeratin 14 형광은 B16-F10 세포에서는 발견되지 않았다. Melan A 형광도 PAM212에서 발견되지 않았다. 결론은 케라티노사이트와 멜라노사이트가 막 구멍을 통하여 통과할 수 없다는 것이다.
◆ 케라티노사이트로 전이된 멜라노솜을 정량하기 위한 모델 시스템
=케라티노사이트로 전이된 멜라노솜의 양은 막에 있는 케라티노사이트·멜라노마 세포 비율에 의존하였다. 연구진은 공식에 따라 멜라노솜 전이 지수를 계산했다. 이것은 공배양중에 있는 멜라노솜 전체 개수와 비교하여 케라티노사이트에서 발견되는 멜라노솜 비율을 의미한다. 케라티노사이트로 전이된 멜라노솜은 시간이 지남에 따라 용량 의존적으로 늘었고, 두 개의 잘 알려진 멜라노솜 전이 자극제인 UVB 및 α -MSH이 사용되었을 때 증가했다. 한편 케라티노사이트로 전이된 멜라노솜은 알려진 멜라노솜 전이 저해제인 niacinamide가 사용되었을 때 농도 의존적으로 감소했다.
◆ 멜라노좀 전달의 근본적인 메커니즘을 탐구하기 위한 모델 시스템
=멜라노사이트와 케라티노사이트에 있는 멜라노솜을 전자현미경으로 확인했다. 전자현미경 실험은 멜라노사이트 세포 수지상dendrite이 멤브레인의 구멍에 침투하는 것을 보여주었고 멤브레인 구멍을 통하여 멜라노사이트-케라티노사이트의 직접적인 접촉이 일어남을 확인했다. 더욱이 몇몇 멜라노사이트의 수지상들은 멤브레인 구멍을 통과하지 않았다. 멤브레인에 있는 멜라노사이트와 케라티노사이트는 Trypsin-EDTA로 분리하였고 케라티노사이트에 있는 PAR-2 함량과 멜라노사이트에 있는 Rab11b은 Elisa kit로 측정했다. Figure 4C에서 볼 수 있는 바와 같이, 공배양 시스템에서 UVB로 유도된 PAR-2 및 Rab11b의 농도는 대조군에 비하여 높게 나타났다.
종합해 보면, 실험 결과들은 이번 실험 방법이 in vitro에서 케라티노사이트로의 멜라노솜 전이를 정량하는데 유용한 모델이고 그 메커니즘을 보다 쉽게 이해할 수 있음을 시사하고 있다. 더욱이 이 모델은 케라티노사이트와 멜라노사이트에서 멜라노솜 전달을 탐색하는 새로운 경향이면서 새로운 기술이다.