부용출 교수(경북대 의학과) 연구팀

[더케이뷰티사이언스]

ABSTRACT

배경: 멜라닌 억제 펩타이드는 피부 과색소침착증 치료제로서 잠재력이 있지만 현재의 많은 펩타이드는 높은 비용 및 낮은 효능의 문제가 있다.

목적: 본 연구의 목표는 화장품 및 의료 분야에 응용할 수 있는 작고 강한 멜라닌 억제 펩타이드를 발견하는 것이다.

방법: 본 연구에서는 위치 스캐닝 합성 테트라-펩타이드 조합 라이브러리를 사용하여 스크리닝함으로써 활성 펩타이드의 시퀀스를 예측하였다. 펩타이드 풀 및 개별 펩타이드의 멜라닌 억제 활성을 알파-멜라닌 세포 자극호르몬(α-MSH)으로 처리한 B16-F10 흑색종세포 및 인간표피 멜라닌세포(HEM)에서 평가 하였다.

결과: 예측된 활성 테트라-펩타이드의 서열은 R-(F / L)-(C / W)-(G / R)-NH2이었다. 시험된 각 테트라-펩타이드 중에서 D3(RFWG-NH2) D5(RLWG-NH2)는 높은 활성을 나타내었다. α-MSH의 일부분과 동일한 서열을 갖는 테트라-펩타이드 D9(FRWG-NH2)도 활성을 나타내었다. 시험된 트리-펩타이드 중 E5(FWG-NH2), E6(LWG-NH2) E7(RWG-NH2)은 상대적으로 활성이 높았다. -펩타이드 F1(WG-NH2)과 모노-펩타이드 G1(G-NH2, 글라이신아마이드)은 활성이 있고 G2(Ac-G-NH2)G3(글라이신)은 활성이 없었다. 펩타이드 D3, E5, F1 G1의 멜라닌 억제 활성은 α-MSH로 자극된 HEM에서 확인되었다. 상업적으로 이용 가능한 G-NH2·HClα-MSH로 자극된 CREB의 인산화 수준, MITF 전사 인자 및 티로시나제의 단백질 수준, 티로시나제의 L-티로신 히드록실라제 활성 및 멜라닌 수준을 억제 하였다.

결론: 글라이신아마이드glycinamide와 트립토파닐글라 이신아마이드tryptophanyl glycinamide를 포함한 작은 펩타 이드는 피부 색소 침착 치료에 잠재적인 가치가 있는 강력한 미백제이다.

Background: Antimelanogenic peptides are potentially useful to treat hyperpigmentation, but many peptides have limited application because of high cost and/or low activity.

Objectives: To identify small and potent peptide inhibitors of cellular melanin synthesis useful for cosmetic and medical applications.

Methods: A positional scanning synthetic tetrapeptide combinatorial library was used for screening of potentially active peptides. Antimelanogenic activities of the peptide pools and individual peptides were evaluated in B16-F10 melanoma cells and human epidermal melanocytes(HEMs) treated with alpha-melanocyte-stimulating hormone(α-MSH).

Results: The predicted active tetrapeptide sequences were R-(F/L)-(C/W)-(G/R)-NH2. Of the individual tetrapeptides tested, D3 (RFWG-NH2) and D5 (RLWG-NH2) exhibited high antimelanogenic activities. Tetrapeptide D9 (FRWG-NH2) with a sequence identical to that of a portion of α-MSH also showed antimelanogenic activity. Of the tripeptides tested, E5(FWG-NH2), E6(LWG-NH2), and E7(RWG-NH2) were relatively more active. Dipeptide F1(WG-NH2) and monopeptide G1(G-NH2, glycinamide) retained activity, but G2(Ac-G-NH2) and G3(glycine) did not. The antimelanogenic activities of peptides D3, E5, F1, and G1 were verified in α-MSH-stimulated HEMs. Commercially available G-NH2·HCl suppressed the phosphorylation levels of cAMP-responsive element binding protein, protein levels of microphthalmia-associated transcription factor and tyrosinase, L-tyrosine hydroxylase activity of tyrosinase, and the melanin levels in stimulated cells.

Conclusions: Small peptides, including glycinamide and tryptophanyl glycinamide, are potent antimelanogenic agents with potential value for the treatment of skin hyperpigmentation.

KEY WORDS

멜라닌Melanin, 펩타이드Peptide, 글라이신아마이드Glycinamide, 멜라노코르틴 1 수용체Melanocortin 1 receptor, 알파 - 멜라닌세포 자극호르몬alpha-Melanocyte-stimulating hormone, 멜라닌세포Melanocytes

 

경북대 의학과 부용출 교수팀(경북대학교 의과대학 분자의 학교실, BK21 플러스, 세포기질연구소)이 미백 기능성 화 장품과 피부 색소질환의 치료에 응용할 수 있는 고효능 저 분자 미백 펩타이드를 발견했다. 80%의 사람들이 피부 톤과 색소 침착 때문에 고민하고 있으며, 특히 기미, 검버 섯, 염증후 색소침착증 등은 미용적인 측면뿐만 아니라 의 학적으로도 중요한 치료 대상이지만 아직까지 안전하고 효 과적인 치료제가 없는 실정이다. 부 교수팀은 차세대 미백 제로 펩타이드에 주목했다. 펩타이드는 아미노산으로 구성 되어 생물학적으로 안전하고, 아미노산 서열에 따라 다양 하고 특이한 효능을 기대할 수 있기 때문이다. 부 교수팀은 PS-SCL 스크리닝 기법을 이용해, 16만 가지의 가능한 테트 라-펩타이드 중에서 최적화된 미백 펩타이드 시퀀스를 예 측했다. 그리고 최종적으로 아미노산 1개 내지 4개로 구성 된 저분자 미백 펩타이드를 발견했다. 이들 미백 펩타이드 의 작용 원리는 멜라닌 세포 자극 호르몬의 수용체 결합을 방해하고 세포 신호 전달을 차단하여 멜라닌 합성 효소의 발현을 억제하는 것이다. 아미노산 1개로 구성된 세상에서 제일 작은 미백 모노-펩타이드인 글라이신아마이드의 경 우 세포 멜라닌 억제 작용이 기존 미백제인 알부틴의 20배 이상인 것으로 나타났다. 부용출 교수는 기존의 펩타이드 는 비싸고, 불안정하고, 피부흡수가 어려운 고분자인 반면 연구팀이 새로 발견한 미백 펩타이드는 고효능 저분자이기 때문에 산업적·의학적 활용성이 매우 높다고 연구 의의 를 밝혔다. 부교수는 자신이 창업한 벤처기업인 루비크라운 과 함께 미백 펩타이드에 대한 특허를 출원했고, 현재 인체 피부 임상시험을 수행 중이다. 이 연구는 중소벤처기업부의 창업성장기술개발사업의 지원으로 수행됐으며, 20191 13일 영국피부과학회지British Journal of Dermatology 온라인 판에 발표됐다.

연구 목표

사람의 피부색은 기본적으로 유전적 요인에 의해 결정되지 만 후천적 요인에 의해서도 많은 변화를 겪게 된다. 멜라닌 색소는 피부 노화, 호르몬 분비, 자외선 노출, 염증 반응 등 에 의해 증가하여 기미, 검버섯, 염증후 색소침착을 야기한 다. 이러한 피부 색소 질환은 그 자체가 치명적이지는 않지 만 심한 정신적 스트레스를 야기할 수 있기 때문에, 미용적 인 측면뿐만 아니라 의학적 측면에서도 치료 대상이 되고 있다. 하지만 아직까지 피부 색소 질환에 대한 안전하고 효 과적인 치료법은 없다. 흥미롭게도 멜라닌세포 자극호르 몬(알파-MSH)은 아미노산 13개로 구성된 펩타이드이다. 이 호르몬은 뇌하수체와 피부에서 분비되고 멜라닌세포의 MC1R 수용체에 결합하여 세포 신호 전달을 개시하고, 그 결과로 타이로시나제 효소가 발현되어 멜라닌이 합성된다. 우리 팀은 멜라닌세포 자극호르몬(알파-MSH)MC1R 수용체에 결합하는 것을 방해하는 펩타이드가 있을 것이라 고 가정하였다. 펩타이드가 MC1R 수용체에 먼저 결합하면 알파-MSH가 수용체에 결합할 수 없게 되고 멜라닌 합성을 유발하는 세포 신호 전달이 억제될 것으로 보았다. 본 연구 에서는 아미노산 4개 이하로 구성된 저분자 미백 펩타이드 를 발견하는 것을 목표로 하였다.

그림 1. PS-SCL을 이용한 활성 펩타이드 시퀀스의 예측 일반적인 테트라-펩타이드 조합 라이브러리의 경우, 20 개의 아미노산이 4 개의 다양성 위치 각각에 결합된 총16 만 가지의 개별 펩 타이드로 구성된다(A). 이 펩타이드들을 위치 스캐닝 포맷으로 배열하면 단지 80 개의 펩타이드 풀로 라이브러리를 구성할 수 있다(B). PS-SCL의 네 가지 위치 하위 라이브러리는 각각 20 가지 펩타이드 풀로 구성되는데, OXXX, XOXX, XXOX 및 XXXO의 하위 펩타이드 라이브러리의 O 위치는 특정 아미노산 잔기는 고정시키고 나머지 X 위치는 모든 20종의 아미노산이 동일한 몰 비율 로혼합되도록 합성 된다. 위치 서브 라이브러리 내 20 개 펩타이드 풀 간의 활성 차이는 O 위치에서 상이한 아미노산에 기인한다.이것 은 활성 펩타이드의 아미노산 서열의 예측에 대한 이론적 배경을 제공한다. 이러한 방법으로 20 x 20 x 20 x 20 = 16만 개펩타이드를 일일이 실험하는 대신 20 + 20 + 20 + 20 = 80개 샘플의 실험으로 활성 펩타이드의 시퀀스를 예측하였다.
그림 1. PS-SCL을 이용한 활성 펩타이드 시퀀스의 예측 일반적인 테트라-펩타이드 조합 라이브러리의 경우, 20 개의 아미노산이 4 개의 다양성 위치 각각에 결합된 총16 만 가지의 개별 펩 타이드로 구성된다(A). 이 펩타이드들을 위치 스캐닝 포맷으로 배열하면 단지 80 개의 펩타이드 풀로 라이브러리를 구성할 수 있다(B). PS-SCL의 네 가지 위치 하위 라이브러리는 각각 20 가지 펩타이드 풀로 구성되는데, OXXX, XOXX, XXOX 및 XXXO의 하위 펩타이드 라이브러리의 O 위치는 특정 아미노산 잔기는 고정시키고 나머지 X 위치는 모든 20종의 아미노산이 동일한 몰 비율 로혼합되도록 합성 된다. 위치 서브 라이브러리 내 20 개 펩타이드 풀 간의 활성 차이는 O 위치에서 상이한 아미노산에 기인한다.이것 은 활성 펩타이드의 아미노산 서열의 예측에 대한 이론적 배경을 제공한다. 이러한 방법으로 20 x 20 x 20 x 20 = 16만 개펩타이드를 일일이 실험하는 대신 20 + 20 + 20 + 20 = 80개 샘플의 실험으로 활성 펩타이드의 시퀀스를 예측하였다.

연구 방법

펩타이드를 구성하는 아미노산은 20종이 있으므로 아미노 산 4개가 연결된 테트라-펩타이드는 20 x 20 x 20 x 20 = 16만 가지가 있다. 이 펩타이드 모두를 일일이 실험하는 것 은 사실상 불가능하므로 우리 팀은 PS-SCL(위치 스캐닝 합 성 펩타이드 조합 라이브러리)을 이용하였다. PS-SCL 테 트라-펩타이드 라이브러리는 20 + 20 + 20 + 20 = 80 개 의 풀로 구성되는데, 각 풀의 펩타이드는 하나의 위치는 특 정 아미노산으로 정해지고 나머지 3개의 위치는 20종의 아 미노산이 같은 비율로 혼합된다. 그러므로 펩타이드 풀의 활성은 그 특정 아미노산 잔기에 의해 결정되며, 이 방법을 통해 활성 펩타이드의 1, 2, 3번 그리고 4번위치의 아 미노산 잔기를 예측할 수 있다.

그림 2. 알파-MSH에 의한 멜라닌 합성 유도 과정 및 멜라닌 억제 저분자 펩타이드의 작용 원리 멜라닌세포 자극호르몬(알파-MSH)은 MC1R 수용체에 결합하여 G 단백질을 활성화시키고(ON) 아데닐레이트 사이클라제 (AC)를 활성화시킨다(A). 생성된 cAMP는 단백질 인산화 효소 A(PKA)를 활성화시켜 CREB의 인산화를 증가시키고, p-CREB은 핵으로 들어 가 MITF의 발현을 증가시키다. MITF 전사인자는 타이로시나제(TYR)의 발현을 유도하여 멜라닌 합성을 증가시킨다. 본 연구에서 발 견한 멜라닌 억제 저분자 펩타이드는 알파-MSH의 시퀀스의 일부분과 동일하였다. 이는 알파-MSH 또는 저분자 펩타이드가 MC1R 수용체에 결합할 때 동일한 아미노산 잔기가 필수적임을 시사한다. 멜라닌 억제 저분자 펩타이드는M C1R 수용체에 결합하여 G 단백 질의 활성화를 막고(OFF), 알파-MSH의 수용체 결합을 방해하여 하류의 세포 신호 전달 과정과 멜라닌 합성을 억제한다 (B).
그림 2. 알파-MSH에 의한 멜라닌 합성 유도 과정 및 멜라닌 억제 저분자 펩타이드의 작용 원리 멜라닌세포 자극호르몬(알파-MSH)은 MC1R 수용체에 결합하여 G 단백질을 활성화시키고(ON) 아데닐레이트 사이클라제 (AC)를 활성화시킨다(A). 생성된 cAMP는 단백질 인산화 효소 A(PKA)를 활성화시켜 CREB의 인산화를 증가시키고, p-CREB은 핵으로 들어 가 MITF의 발현을 증가시키다. MITF 전사인자는 타이로시나제(TYR)의 발현을 유도하여 멜라닌 합성을 증가시킨다. 본 연구에서 발 견한 멜라닌 억제 저분자 펩타이드는 알파-MSH의 시퀀스의 일부분과 동일하였다. 이는 알파-MSH 또는 저분자 펩타이드가 MC1R 수용체에 결합할 때 동일한 아미노산 잔기가 필수적임을 시사한다. 멜라닌 억제 저분자 펩타이드는M C1R 수용체에 결합하여 G 단백 질의 활성화를 막고(OFF), 알파-MSH의 수용체 결합을 방해하여 하류의 세포 신호 전달 과정과 멜라닌 합성을 억제한다 (B).

연구 결과

알파-MSH로 자극한 멜라닌 세포에서 PS-SCL의 테트 라-펩타이드 풀을 시험했을 때 1번 위치의 R(아르기닌) 잔 기, 2번 위치의 F(페닐알라닌) 또는 L(류신) 잔기, 3번 위 치의 C(시스테인) 또는 W(트립토판) 잔기 및 4번 위치의 G(글라이신) 또는 R(아르기닌) 잔기가 멜라닌 억제 활성에 중요한 것으로 나타났다.

위 결과에 기초하여, 1번 위치에 R 잔기, 2 번 위치에 F 또 는 L 잔기, 3번 위치에 C 또는 W 잔기 및 4번 위치에 G 또는 R 잔기를 가진 테트라-펩타이드 8종을 개별적으로 합성하 여 실험한 결과 RFWG-NH2RLWG-NH2은 멜라닌 억 제 활성이 있었고, 다른 것들은 활성이 없었다. 이들 활성 테 트라-펩타이드는 알파-MSH, Ac-SYSMEHFRWGKPV-NH2에 포함된 FRWG 서열과 유사하였고, 추가로 합성된 FRWG-NH2도 멜라닌 억제 활성이 있었다.

활성 테트라-펩타이드로부터 아미노산 몇 개를 제외시 킨 트리-펩타이드 중 FWG-NH2, LWG-NH2 RWG-NH2은 멜라닌 억제 활성이 있었다. 또한, -펩타이드 WG-NH2와 모노-펩타이드 G-NH2도 멜라닌 억제 활성 이 있었지만 Ac-G-NH2, G는 활성이 없었다.

아미노산 하나로 이루어진 모노-펩타이드인 G-NH2 은 알파-MSH에 의해 유도된 CREB의 인산화, 전사인자 MITF의 발현, 그리고 타이로시나제의 발현을 억제하였다. G-NH2(분자량 74)는 알부틴(분자량 272)에 비해 매우 작지만 멜라닌 억제 활성은 20배 이상 더 강력하였다.

 

연구 의의

본 연구의 첫 번째 의의는 PS-SCL 라이브러리를 이용하는 스크리닝 방법을 통해 테트라-펩타이드 중에서 멜라닌 억 제 활성이 가장 강한 펩타이드를 발견한 것이다. 두 번째 의 의는 이들 활성 펩타이드의 서열을 알파-MSH과 비교하여 두 서열 간에 공통점을 발견한 것이다. MC1R 수용체에 결합하는데 필수적인 아미노산 서열을 발견하였다. 본 연구 에서 발견된 멜라닌 억제 저분자 펩타이드는 MC1R 길항제 로 작용한다. 이들 저분자 펩타이드는 알파-MSH 호르몬과 구조가 유사하기 때문에 MC1R 수용체에 미리 결합하여 알 파-MSH 호르몬의 수용체 결합을 방해할 수 있다. 이를 뒷 받침하여 저분자 펩타이드는 알파-MSH에 의해 유도되는 CREB의 인산화를 억제하였고, MITF 전사인자 및 타이로시나제 발현도 억제하였다. 본 연구의 세 번째 의의는 발견된 멜라닌 억제 펩타이드가 고효능 저분자라는 점이다. 기존의 펩타이드는 대부분 고분자이기 때문에 높은 합성 비용, 경 피 흡수의 어려움 및 빠른 생물학적 분해 등 여러 단점이 있 다. 이에 반해 본 연구에서 발견한 펩타이드는 저분자일 뿐 만 아니라 멜라닌 억제 활성도 강하여 산업적 및 의학적 응 용성이 매우 높다. 특히 아미노산 하나로 이루어진 모노-펩 타이드인 G-NH2는 세상에서 가장 작은 미백 펩타이드이 다. 펩타이드는 무독성 생체 성분이고 높은 생물학적 활성 이 가능하기 때문에 차세대 바이오 의약품과 화장품 소재로 주목 받고 있다. 현재 이들 펩타이드의 안전성과 효능에 대 한 임상시험을 수행 중이며, 피부색소침착의 치료에 대한 획기적인 전기가 마련될 것으로 기대한다.

경북대 의학과 부용출 교수(경북대학교 의과대학 분자의학교실, BK21 플러스, 세포기질연구소) 연구팀. 사진 위 왼쪽부터 김재헌 연구원, 최민아 연구원, 석진경 박사, 사진 아래 왼쪽부터 하재원 연구원, 부용출 교수 , 송혜림 연구원.
경북대 의학과 부용출 교수(경북대학교 의과대학 분자의학교실, BK21 플러스, 세포기질연구소) 연구팀. 사진 위 왼쪽부터 김재헌 연구원, 최민아 연구원, 석진경 박사, 사진 아래 왼쪽부터 하재원 연구원, 부용출 교수 , 송혜림 연구원.

 

 

 

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