Derma-CLOCK®의 생체리듬 및 miRNA를 이용한 DNA 손상 회복능
Derma-CLOCK®의 생체리듬 및 miRNA를 이용한 DNA 손상 회복능
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RADIANT

ABSTRACT

자외선은 DNA 손상, 산화 스트레스 및 염증의 원인이며, 피부 면역 시스템을 억제하여 피부 노화 및 피부암을 유발한다. 자외선에 의한 DNA 손상은 생체시계와 miRNA 발현에 의해 조절된다고 알려져 있다. 하늘타리 추출물(Trichosanthes kirilowii root extract), TKE은 당뇨병, 해열, 기침, 천식에 효과가 있고 얼굴빛을 환하게 만들며 얼굴과 손의 주름을 개선시키는 효능이 있다고 알려져 있다. 그러나 피부세포의 DNA 손상 복구에 대한 영향이 밝혀지지 않아 본 연구를 통해 확인하고자 하였다. 연구 결과, TKE가 생체리듬 유전자인 BMAL1의 발현 조절을 통해 DNA 손상 회복을 방해하는 miR-142-3p 발현을 억제함을 확인하였으며 TKE의 DNA 손상 복구능을 확인할 수 있었다. TKE를 Derma-CLOCK®이라 명명하고 화장품 소재로 활용하고자 하였다.

RADIANT 김남경 이사가 지난 6월 서울 코엑스에서 열린 ‘인-코스메틱스 코리아 2019’에서 ‘마이크로 RNA와 생체리듬을 토대로 진보된 피부 리듬’을 설명하고 있다.
RADIANT 김남경 이사가 지난 6월 서울 코엑스에서 열린 ‘인-코스메틱스 코리아 2019’에서 ‘마이크로 RNA와 생체리듬을 토대로 진보된 피부 리듬’을 설명하고 있다.

연구 배경

피부는 신체의 모든 기관들과 마찬가지로 노화가 진행되어 기능이 쇠퇴하는데, 피부 노화의 원인에는 신체 노화에 따른 피부 노화(내적 요인)와 여러 해로운 환경 노출에 따른 피부 노화(외적 요인)가 있다. 특히, 외적 요인에 의한 노화 중 자외선UV에 의한 광피부노화가 피부 노화를 촉진하는 주요 환경 요인으로 작용한다. 이러한 요인으로 노화된 피부는 주름 형성, 피부톤 손실 및 피부 처짐 등의 현상이 나타난다.

자외선 중 에너지 강도가 가장 강한 자외선 BUVB는 DNA 손상, 산화 스트레스 및 염증의 원인이며, 피부 면역 시스템을 억제하여 피부노화 및 피부암을 유발한다. 또한, UVB는 피부에서 시클로 부탄 피리미딘이량체(cyclobutane pyrimidine dimmers), CPDs 및 6-4 광분해 생성물(6-4 photoproducts), 6-4 PPs의 형성을 유도하는데, 이 물질들은 돌연변이 DNA 병변을 발생시키고, 이는 세포의 DNA 손상, 세포 노화 및 사멸을 유발한다.

CPDs 및 6-4 PPs는 nucleotide excision repair(NER)로 알려진 과정을 통하여 회복된다. 이 NER은 UV로 유발되는 DNA 병변의 회복을 위한 중요한 과정이며, 이 과정은 DNA 손상 위치의 3' 말단의 한 부분과 다른 5' 말단의 부분이 절단됨으로써 단일 가닥 단편 형태의 손상된 DNA가 삭제되고, 삭제된 올리고뉴클레오타이드는 DNA 회복 합성에 의해 새로운 올리고뉴클레오타이드로 교체된 후 DNA 연결효소에 의해 완전히 회복된다.

생체리듬(circadian rhythm)은 인간을 포함하는 거의 모든 생물에서 호르몬 분비, 체온 및 수면 패턴과 같은 행동 및 일상 리듬을 조절한다. 포유류의 일주기 시계 시스템은 central oscillator로 구성된다. 이 시스템은 시교차상액(suprachiasmatic nucleus), SCN과 peripheral oscillators 에 의해 제어된다. 핵심 core oscillator는 두 개의 heterodimeric transcriptional factors인 CLOCK 및 뇌와 근육의 aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator(ARNT-like protein-1, BMAL1)를 포함하며, 이들의 전사억제자로 알려진 PeriodPer와 CryptochromeCry을 활성화 시킨다.

miRNA는 표적 mRNA의 3'- 비 번역 영역(UTR)에 결합하여 단백질 번역을 방해함으로써 유전자 발현의 조절에 관여하는 작은 비 - 코딩 RNA 분자이다. 수많은 연구에서 miRNA는 세포 증식, 세포 사멸, 발달, 신진 대사 및 분화를 포함한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이전의 연구들은 miRNA가 circadian clock의 조절에 관련되어 miRNAmiR 219가 circadian period의 길이를 조절하는 반면에 miR-132는 Per 유전자 전달 및 단백질 안정성을 조절한다는 것을 밝혀냈다. miR-142-3p는 다른 세포에도 존재하지만, 마우스 SCN, NIH3T3 및 인간 293ET 세포에서 BMAL1의 번역 후 조절에 관여한다. 그러나, miR-142-3p가 피부 세포에서 BMAL1의 사후 전사 조절을 매개하는 분자 기작은 아직 밝혀지지 않았으며, 여러 연구에서 자외선 노출과 keratinocytes에서 miRNA 발현의 변화 사이의 연관성이 보고된 바 있다.

최근의 연구 결과들에 따르면 DNA 손상 반응이 생체시계와 연관이 있는 것으로 확인되었으며, 이는 피부에서 보통의 생물학적 주기 리듬 및 유전자 발현 레벨이 UVB 방사선에 의해 억제될 수 있음을 의미하는 것으로, 인간 각질 세포에서의 Per, Clock 및 Bmal1 유전자 연구에 의해 입증되었다. 또한, 각질세포에서 miRNA 발현의 변화가 UVB 방사선 노출 사이에 연관이 있다고 보고된 바 있으며, 최근에는 miR-142-3p가 시계 유전자인 BMAL1의 유전자 발현 조절에 영향을 주는 것이 확인되었다.

하늘타리(Trichosanthes kirilowii)는 다년생초본 식물로 박과의 식물 중 하나이다. 담쟁이 넝쿨과의 식물이어서 하늘로 타고 올라가는 듯한 모습과 많은 약리작용이 있어 신의 선물이라고 불린다. 하늘타리의 전초(꽃, 씨, 잎, 뿌리 등)는 모두 사용될 수 있으며, 동아시아에서 당뇨, 암 관련 증상, 기침 및 가슴 농양 환자를 위한 전통 의학에 사용되어 왔다. 하지만 하늘타리의 ‘피부 세포에서의 DNA 손상 복구’에 대한 영향 및 효과에 대한 연구가 이루어지지 않은 실정이다.

 

연구 결과

Ⅰ하늘타리 추출물의 UVB에 의한 DNA 손상 복구 증진 효과 확인

1) 하늘타리 추출물의 세포 독성 여부 확인

하늘타리 추출물의 세포독성 여부를 확인한 결과, 100 ㎍/ml 이하 농도의 하늘타리 추출물을 처리한 HaCaT 세포에서는 유의적인 세포독성 현상이 나타나지 않았으며, 고농도인 200 ㎍/ml 농도의 하늘타리 추출물을 처리한 HaCaT 세포에서만 세포독성이 확인되었다 (그림 1A). 이러한 결과를 통하여, 하늘타리 추출물의 농도 중 100 ㎍/ml 농도를 선택하여 하기 실험에서 사용하였다.

2) 하늘타리 추출물의 UVB 노출로 인한 DNA 손상 복구 확인

UVB 노출로 유도된 DNA 손상 복구에 대한 하늘타리 추출물의 효과를 확인하기 위하여, Comet assay(SCGE, 단일 세포전기영동법)를 이용하여 DNA 손상 정도를 tail 측정을 통해 확인하였다.

실험 결과, ‘UVB에 노출한 후, 100 ㎍/ml 농도의 하늘타리 추출물을 처리한 HaCaT 세포’의 경우, 비교대조군인 ‘하늘타리 추출물을 처리하지 않고 UVB에 노출된 HaCaT 세포’와 비교했을 때 DNA 손상 및 DNA 단편이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, UVB에 의해 유도된 DNA 손상으로부터 하늘타리 추출물이 HaCaT 세포를 보호한다는 것을 확인하였다. 상기의 실험 결과로 하늘타리 추출물이 DNA 손상 복구뿐만 아니라, UVB에 의해 유도된 DNA 손상 보호에도 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다 (그림 1B).

그림 1. 하늘타리 추출물의 UVB에 의한 DNA 손상 복구 증진 효과 확인
그림 1. 하늘타리 추출물의 UVB에 의한 DNA 손상 복구 증진 효과 확인

Ⅱ 하늘타리 추출물의 BMAL1의 발현 조절 확인

이전 연구 보고에 따르면, 뉴클레오타이드 절단 회복의 일주기 리듬(Circadian Oscillation)은 DNA 손상을 확인하는 단백질인 XPA 단백질의 일주기 리듬과 관계가 있다. 이 XPA 단백질은 CLOCK과 BMAL1에 의해 양성조절 되며, CRY와 PER에 의해 음성조절되므로, 절단 회복은 일주기 리듬에 의존적이다.

BMAL1은 일주기 리듬 조절에 필수적인 역할을 하는 주요 생체 시계 인자이다. 본 실험에서는 하늘타리 추출물의 DNA 손상 회복을 조절하는 분자적 기작을 확인하기 위해, HaCaT 세포에서 BMAL1의 발현 변화를 확인하고자 하였다.

먼저 하늘타리 추출물이 HaCaT 세포에서 BMAL1의 mRNA 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 실험 결과, ‘하늘타리 추출물을 처리하지 않고 UVB 방사능에 노출된 HaCaT 세포’인 비교대조군의 경우, 대조군인 ‘UVB 방사능 비노출 및 하늘타리 추출물 비처리 HaCaT 세포’에 비하여 BMAL1의 mRNA 발현이 감소되었으며, ‘UVB 방사능에 노출되고 하늘타리 추출물을 100 ㎍/ml로 처리한 HaCaT 세포’에서는 BMAL1의 mRNA 발현이 증가한 것을 확인하였다. 이로 인하여 하늘타리 추출물이 BMAL1의 mRNA 발현에 영향을 미친다는 것을 확인하였다 (그림 2A).

그림 2. 하늘타리 추출물의 BMAL1의 발현 조절 확인
그림 2. 하늘타리 추출물의 BMAL1의 발현 조절 확인

단백질 발현을 확인해 본 결과, ‘하늘타리 추출물을 처리하지 않고 UVB 방사능에 노출된 HaCaT 세포’인 비교대조군의 경우, 대조군인 ‘UVB 방사능 비노출 및 하늘타리 추출물 비처리 HaCaT 세포’에 비하여 BMAL1의 단백질 발현이 감소되었으며, ‘UVB 방사능에 노출되고 하늘타리 추출물을 100 ㎍/ml로 처리한 HaCaT 세포’에서는 BMAL1의 단백질 발현이 증가한 것을 확인하였다. 실험결과를 종합해보았을 때, 각질세포에서의 특정 세포 반응 기작에 하늘타리 추출물 매개 DNA 손상 복구가 포함되어 있을 것이라 판단되었다.

Ⅲ 하늘타리 추출물의 miR-142-3p의 억제를 통한 BMAL1 발현 상향조절 확인

일반적으로, BMAL1은 miR-142-3p의 억제를 통해 상향조절되어 DNA 손상 복구를 증진시킨다고 알려져 있다. 이를 확인하기 위해 먼저 miR-142-3p와 BMAL1의 상관 관계를 확인하기 위해 miRNA mimic을 사용하여 확인해 본 결과, miR-142-3p mimic에서 BMAL1의 발현이 감소함을 확인하였으며, miR-142-3p이 BMAL1발현의 영향 미침을 확인할 수 있었다. (그림 3 A, B).

다음으로 하늘타리 추출물이 miR-142-3p에 미치는 영향을 확인한 결과, 비교대조군인 ‘하늘타리 추출물을 처리하지 않고 UVB 방사능에 노출된 HaCaT 세포’의 경우, 대조군인 ‘UVB 방사능 비노출 및 하늘타리 추출물을 비처리 HaCaT 세포’에 비해 miR-142-3p의 발현이 증가한 반면, ‘UVB에 노출된 후 하늘타리 추출물 100 ㎍/ml를 처리한 HaCaT 세포’의 경우 miR-142-3p의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 HaCaT 세포에서의 하늘타리 추출물 매개 DNA 손상 복구가 miR-142-3p의 발현 억제와 연관성이 있음을 확인한 결과였다. (그림 3C).

그림 3. 하늘타리 추출물의 miR-142-3p 조절능 확인
그림 3. 하늘타리 추출물의 miR-142-3p 조절능 확인

언급된 실험 외에도, 콜라겐 합성능, 콜라겐분해효소MMP 저해능을 확인한 바 있으며, TKE가 포함된 크림을 이용한 임상 실험을 통해 탄력증가 및 진피치밀도 증가를 확인할 수 있었다. 결론적으로 Derma-CLOCK®의 항노화 효능이 생체리듬과 miRNA를 이용한 DNA 손상 회복능에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

 


REFERENCES

1. Sancar A, Lindsey-Boltz LA, Kang TH, Reardon JT, Lee JH, Ozturk N: Circadian clock control of the cellular response to DNA damage. FEBS Lett 584: 2618-2625, 2010.

2. Kang T and Sancar A: Circadian regulation of DNA excision repair: implications for chrono- chemotherapy. Cell Cycle 8: 1665-1667, 2009.

3. Kawara S, Mydlarski R, Mamelak AJ, Freed I, Wang B, Watanabe H, et al: Low-dose ultraviolet B rays alter the mRNA expression of the circadian clock genes in cultured human keratinocytes. J Invest Dermatol 119: 1220-1223, 2002.

4. Liu K and Wang R: MicroRNA-mediated regulation in the mammalian circadian rhythm, J Theor Biol 304: 103-110, 2012.

5. Shende VR, Neuendorff N and Earnest DJ: Role of miR-142-3p in the post-transcriptional regulation of the clock gene Bmal1 in the mouse SCN. PLoS One 8:e65300, 2013.

6. Zhou BR, Xu Y, Permatasari F, Liu W, Li W, Guo X, et al: Characterization of the miRNA profile in UVB-irradiated normal human keratinocytes. Exp Dermatol 21: 317-319, 2012.

7. Tan X, Zhang P, Zhou L, Yin B, Pan H and Peng X: Clock-controlled mir-142-3p can target its activator, Bmal1. BMC Mol Biol 13: 27, 2012.

8. Geyfman M, Kumar V, Liu Qiang, Ruiz R, Gordon W, Espitia F, et al: Brain and muscle arnt-like protein-1 (BMAL1) controls circadian cell proliferation and susceptibility to UVB-induced DNA damage in the epidermis. PNAS 109: 11758-11763, 2012.

 


논문명 Trichosanthes kirilowii extract enhances repair of UVB radiation-induced DNA damage by regulating BMAL1 and miR-142-3p in human keratinocytes

저자 주지혜, 홍인기, 김남경, 최은미

게재 저널 MOLECULAR MEDICINE REPORTS (2018년 2월)

제품 정보

▶ 제품명: Derma-CLOCK®

▶ INCI name: Trichosanthes kirilowii root extract

▶ 전성분명 : 하늘타리뿌리추출물

▶ 중국수출명 : 栝楼(TRICHOSANTHES KIRILOWII)根提取物

▶ 적용 분야: 스킨 케어 제품류 (피부재생크림, 민감성 케어 등), 바디케어 제품류

▶ 관련특허 : miR-142-3p의 활성 조절을 통한 UVB 피부 손상 복구용 화장료 조성물 [제10-1828056호]

 


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